Fungi wat plante aanval, lei tot groot verliese in plantproduksie en ook tot verliese in opbrengs nadat die produkte geoes is. Die beheer van hierdie fungi deur chemiese fungisiede lewer komplikasies vanweë menslike en omgewingstoksisiteit. Die koste en die ontwikkeling van weerstand deur plantpatogeniese fungi teen fungisiede lewer ook probleme. Sekondêre plantmetaboliete het ‘n goeie potensiaal as antifungusverbindings. Die doel van die studie was om die aktiwiteit van
Hierdie artikel is die vertaalde weergawe en is beskikbaar gestel om ‘n breër lesersgroep te bereik. Die oorspronklike Engelse artikel is beskikbaar hier:
This article is the translated version, made available to provide access to a larger readership, of which the original English article is available here:
Patogeniese fungi in plante bedreig voedselsekuriteit wêreldwyd terwyl meer as 800 miljoen mense nie genoeg kos het nie en ten minste 10% van die kos wat geproduseer word as gevolg van aanvalle deur mikroorganismes verlore gaan (Strange & Scott
Sintetiese swamdoders is die belangrikste manier om plantpatogene te beheer. Veiligheidsrisiko’s, die hoë koste, newe-effekte en die ontwikkeling van weerstandigheid jeens die gebruik van hierdie fungisiede wek egter ernstige kommer (Tripathi & Dubey
Plante is goeie kandidate vir die soektog na swamdodende verbindings aangesien hulle soms onder moeilike omstandighede bestaan en deur verskillende organismes, veral fungi, aangeval word (Hostettman et al.
Die blare, bas en wortels van
Ons het in hierdie studie die belangrikste antifungus verbinding in die plant geïsoleer en gekarakteriseer. Ons het ook die antifungus aktiwiteit teen belangrike patogene in plantfungi bepaal, asook die sitotoksisiteit van die verbinding.
Blare van
Verpoeierde gedroogde blare van
Oplosmiddel-oplosmiddel ekstraksie is ’n gewilde tegniek wat gebruik word om monsters vir kwalitatiewe en kwantitatiewe ontleding voor te berei. Dit is ’n proses waar een bestanddeel van ’n mengsel geskei word deur dit op te los in ’n oplosmiddel waarin dit oplosbaar is, terwyl ander konstituente nie oplosbaar is nie of ten minste minder oplosbaar is (Holden
’n Bio-outografiese metode wat in ons laboratorium ontwikkel is (Masoko & Eloff
Rf = afstand deur verbinding beweeg/afstand deur oplosmiddelfront beweeg
Die mikroverdunningsmetode wat deur Eloff (
Die gedroogde DCM-ekstrak van
Die monsters se sitotoksisiteit teen die Vero-niersellyn in ape (wat van die Departement Tropiese Dieresiektes, Universiteit van Pretoria, verkry is) is getoets. Die selle is in minimale noodsaaklike medium (Highveld Biological, Johannesburg, Suid-Afrika) onderhou. Dit is met 0.1% gentamisien (Virbac) en 5% fetale kalfserum (Adcock-Ingram) aangevul. Die selle is vir die toets voorberei deur selsuspensies uit samevloeiende monolaagkulture voor te berei en dit teen ’n digtheid van 0.5 x 103 selle in elke putjie in die 96-put mikrotiterplaat te plaas. Nadat dit oornag teen 37 °C in ’n 5% CO2-inkubeerder inkubeer is, is die subsamevloeiende selle in die mikrotiterplaat in die sitotoksisiteitstoets gebruik. Verdunnings van die plantekstrak is in groeimedium (1 μg/mL tot 1000 μg/mL) voorberei. Die lewensvatbare selgroei na 120 h se inkubering met plantekstrakte/monsters is bepaal deur die tetrasoliumgebaseerde kolorimetriese toets (MTT-toets) wat deur Mosmann (
Die DCM-ekstrak wat uit die oplosmiddel-oplosmiddel ekstraksie verkry is, is op silikajel 60 aan kolom-chromatografie onderwerp. Die kolom is met 100% DCM uitgeloog en die polariteit van die loogmiddel is daarna deur die byvoeging van metanol (MeOH) verhoog. Aanvanklik is 1000 mL 100% DCM gebruik, gevolg deur mengsels van 10% MeOH, 20% MeOH, 30% MeOH, 40% MeOH, 50% MeOH, 60% MeOH, 80% MeOH, almal in DCM. Laastens is die kolom met 100% MeOH uitgewas. Altesaam nege fraksies van 1000 mL is versamel. Fraksies is volgens die in samestelling op dunlaagchromatogramme saamgegroepeer. Die fraksies is gekonsentreer en gechromatografeer om onsuiwerhede te verwyder ten einde die aktiewe verbinding te verkry. Ten einde te bevestig dat die isolering van die antifungus verbinding in die ekstrak nie ’n artefak van die isoleringprosedure was nie, is bio-outografie op die geïsoleerde verbinding en die ongesuiwerde ekstrak in DCM uitgevoer.
Kernmagneetresonansiespektroskopie (1H NMR en 13C NMR) is met ’n Varian Inva 400 MHz-spektrometer gedoen om die struktuur van die verbinding te bevestig. Die geïsoleerde verbinding uit
Die 46, 67 g, asetoonekstraktevan verpoeierde
Die dichlorometaan(DCM)-fraksie, wat die hoogste aktiwiteit gehad het,is gekies om aktiewe verbindings deur ’n biotoetsgerigte fraksionering te isoleer. Fraksies wat in ’n oopkolom silikajelchromatografie uit die DCM-ekstrak gewas is, is volgens hulle DLC-samestelling sgekombinaar, gekonsentreer en gechromatografeer om onsuiwerhede te verwyder. Dit het ’n wit suiwer presipitaat gelewer. Die aantal aktiewe van antifungus verbindings is ondersoek deur ’n bio-outografie van dunlaag chromatogramme met ’n suspensie P. janthelium konidia te spuit (
Chromatogram en bio-outogram van die dichlorometaan-fraksie wat met benseen:etanol:amoniumhidroksied 90/9/1 (1) ontwikkel is en die verbinding wat uit die ekstrak (2) geïsoleer is, wat met vaniliensuur-swawelsuur(a) en ’n konidia suspensie van
Die Rf-waarde van aktiewe verbindings kan dalk help om die isolering van antifungus verbindings uit ander plantekstrakte te derepliseer. Die Rf-waarde van die ekstrak- en geïsoleerde verbindings was 0.08 met BEA (bensien:etanol: amoniumhidroksied 90/9/1) (Kotze & Eloff
Die verbinding is as ’n wit presipitaat geïsoleer. NMR-spektroskopie het die verbinding as oleanolsuur geïdentifiseer (
Die struktuur van oleanolsuur wat uit die dichorometaanfraksie van
Wanneer ’n mens bioaktiewe verbindings uit plantekstrakte isoleer, is dit altyd moontlik dat die belangrikste aktiewe verbindings deur die isoleringsproses onaktief gemaak kan word en dat ’n minder aktiewe verbinding op die ou einde geïsoleer kan word. Om hierdie moontlikheid uit te skakel, is bio-outografie op die ruekstrak en die geïsoleerde oleanolsuur gedoen.
Die resultate van die bio-outografie (
Om die mate waartoe die aktiwiteit toegeneem het deur die oleanolsuur te isoleer asook die sensitiwiteit jeens verskillende swampatogene te evalueer, is die MK teen verskeie patogene bepaal (
MIK-waarde in μg/mL van
Mikro-organisme | Oleanolsuur | Amfoterisien B | |
---|---|---|---|
160 | 250 | 0.78 | |
120 | 250 | 0.31 | |
120 | 190 | 7.5 | |
470 | 250 | 40 | |
20 | 8 | 7.5 | |
20 | 2 | 25 | |
20 | 50 | 20 | |
20 | 20 | 40 | |
60 | 16 | 40 | |
Gemiddelde | 130 | 130 | 18.1 |
Daar was verskeie gevalle waar die
Omdat die aktiwiteit van die ekstrak vergelykbaar was met die aktiwiteit van die verbinding beteken dit dat die aktiwiteit nie honderdvoudig vermeerder het nie, ten spyte van die feit dat ongeveer 99% van die ‘sogenaamde onaktiewes’ uit die ruekstrak verwyder is. Die analise is deur bio-outografie van dieselfde massa gedoen. Die mees waarskynlike verduideliking hiervoor is dat daar ’n groot mate van sinergisme moes plaasgevind het. Die verbindings wat sinergisties optree, was nie as sodanig aktief nadat hulle tydens bio-outografie van ander verbindings geskei is nie. ’n Ander moontlike verduideliking is dat ander vlugtige verbindings in die ruekstrak teenwoordig kon gewees het en dat hulle verdamp het tydens die lang tydperk waartydens die oplosmiddel van die chromatogramme verwyder is voordat dit met die fungi gespuit is. Alternatiewelik kon van die antifungus verbindings tydens die isoleringsproses vernietig gewees het.
Amfoterisien B was aktief met ’n gemiddelde MIK-waarde van 18 μg/mL, maar in sommige gevalle het die onsuiwer ekstrak ’n hoër aktiwiteit teenoor sekere fungi getoon as amfoterisien B. Dit dui daarop dat ruekstrak moontlik gebruik kan word om plante teen sekere fungi te beskerm.
As die gevolgtrekking waartoe ons in die vorige paragraaf gekom het, korrek is, naamlik dat daar substansiële aktiwiteit in die verbinding buite oleanolsuur geleë moet wees, kan ’n mens die algehele aktiwiteit van die ruekstrak en die geïsoleerde verbinding bereken (Eloff
Totale aktiwiteit van die dichlorometaanfraksie en oleanolsuur van
Monsters | Massa in mg | Gemiddelde minimum inhibisiekonsentrasie in mg/mL | Totale aktiwiteit in mL |
---|---|---|---|
DCM-ekstrak | 7820 | 0.13 | 60 154 |
Oleanolsuur | 1204 | 0.13 | 9 262 |
DCM, dichlorometaan
Die rede waarom ons die sitotoksisiteit van die ekstrak en oleanolsuur wou bepaal, is omdat, as die sitotoksisiteit laag is, daar ’n moontlikheid is dat dit gebruik kan word om swampatogene op eetbare plante te behandel. As die toksisiteit hoog is, is daar egter steeds ’n moontlikheid dat dit nuttig in die tuinboubedryf gebruik kan word (Eloff, Angeh & McGaw
Die selsitotoksisiteit van
Seltoksisiteit kan ook deur die LK50-waardes uitgedruk word. Die letale konsentrasie 50 is die konsentrasie wat tot die afsterwe van 50% van die selle lei. Dit word uit die regressiekurwe bereken.
Baie antifungus verbindings is toksies omdat daar heelwat meer ooreenstemmende metaboliese weë tussen fungi en soogdiere is as tussen bakterieë en soogdiere. Daar is dus minder spesifieke teikens wat aangespreek kan word. Die belangrike vraag is hoe die toksisiteit van die teikenorganismes met die seltoksisiteit verband hou. Die selektiwiteitsindeks kan bereken word deur LC50 in (μg/mL)/MIK in (μg/mL).Hoe hoër hierdie waarde, hoe veiliger kan die produk onder beheerde toestande gebruik word (
Die selektiwiteitsindeks van ruekstrak en oleanolsuur teen 10 fungi.
Mikro-organismes | Ruekstrak se LC50 (μg/mL) | Ruekstrak se minimum inibisiekonsentrasie (μg/mL) | Selektiwiteitsindeks (Ruekstrak) | Oleanolsuur LC50 (μg/mL) | Oleanolsuur se minimum inhibisiekonsentrasie (μg/mL) | Selektiwiteitsindeks (oleanolsuur) |
---|---|---|---|---|---|---|
413 | 310 | 1.0 | 129 | 250 | 0.5 | |
413 | 160 | 2.5 | 129 | 250 | 0.5 | |
413 | 120 | 3.0 | 129 | 250 | 0.5 | |
413 | 120 | 3.0 | 129 | 190 | 0.7 | |
413 | 470 | 0.9 | 129 | 250 | 0.5 | |
413 | 20 | 21 | 129 | 8 | 16 | |
413 | 20 | 21 | 129 | 2 | 64 | |
413 | 20 | 21 | 129 | 50 | 2.6 | |
413 | 20 | 21 | 129 | 20 | 6.5 | |
413 | 60 | 7.0 | 129 | 16 | 8.0 |
Die ruekstrak se selektiwiteitsindeks teen die mikro-organismes
Oleanolsuur se hoë selektiwiteitsindeks van 16 en 64 teen
Dit lyk asof daar ’n groter potensiaal vir die gebruik van plantekstrakte is as vir die geïsoleerde oleanolsuur. Dit sal baie minder kos om die ruplantekstrak te produseer. Daar was groot verskille in die verskillende patogene se sensitiwiteit teenoor die ruekstrak. Dit kan waardevol wees omdat dit daarop dui dat die aktiwiteit teen ’n basiese metaboliese middel is wat in al die fungi teenwoordig is.
Omdat baie swamdodende middels ook hoogs toksies is, was dit belangrik om die seltoksisiteit en die selektiwiteitsindeks te bepaal. Onder beheerde toestande kan die ruekstrak en oleanolsuur gebruik word teen infeksies wat deur sekere van die patogene veroorsaak word met ’n redelik goeie selektiwiteitsindeks. Dit bied dus ‘n relatiewe lae toksisiteitsbedreigings. In die geval van ander patogene sal nóg die ruekstrak nóg die oleanolsuur van enige waarde wees omdat dit toksies is. ’n Mens moet egter in gedagte hou dat die seltoksisiteit nie noodwendig met toksisiteit deur ander roetes toegedien aan diere verband hou nie. As die toksiese komponent ingeneem word en dit teen die lae pH in die ingewande vernietig word, of nie uit die ingewande in die bloed opgeneem word nie of vinnig ontgiftig word, kan die toksisiteit baie later wees. Dit is ook moontlik dat ’n meer toksiese verbinding ná die opname van die ekstrak kan ontwikkel, wat die belang van
Ons is dankbaar teenoor die kurator van die Laeveld Nasionale Botaniese Tuin wat ons toegelaat het om plantmateriaal te versamel. Prof. Lise Korsten (Departement van Plant Pathologie, Universiteit van Pretoria), wie die plant kultivar van die fitopatogene wat gebruik is, voorsien het. Hierdie navorsing is deur die Nasionale Navorsingstigting (NNS) en die Universiteit van Pretoria ondersteun.
Die outeurs verklaar dat hulle geen finansiële of persoonlike verbintenis met enige party wat hom nadelig of voordelig kon beïnvloed het in die skryf van hierdie artikel nie.
M.M. het die werk as deel van ’n MSc-studie gedoen. L.M. het gehelp om die aktiewe verbinding te isoleer en die struktuur op te klaar. J.N.E. het die projek geïdentifiseer, die studieleiding gedoen en die manuskrip hersien en dit ingedien.
Kernmagnetiese resonansiespektrum van geïsoleerde verbindings.